人教版生物选修一课题3--血红蛋白的提取和分离

每个肽链环绕一个亚铁血红素基团， 此基团可携带一分子氧或一分子二 氧化碳，血红蛋白因含有血红素而 呈红色。 使微生物的蛋白质发生变性、蛋白质的空间结构被 破坏。 大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或 琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。 根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大 小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行 分离。 在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强 酸或强碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混 合溶液。 能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响， 维持PH基本不变。 通常由1－2 种缓冲剂溶解于水 中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不 同PH范围内使用的缓冲液。 磷酸缓冲液 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 ①许多重要的生物大分子，如多肽、 核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下， 这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用 下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的 电极移动。③电泳利用了待分离样品中各种分 子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状 的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从 而实现样品中各种分子的分离。 琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。 1、在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸 钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳。聚丙稀酰胺凝 胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙 烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的 具有三维网状结构的凝胶。 N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联） 丙烯酰胺和交联剂 N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应 样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定 （一）蛋白质提取和分离步骤 （二）操作过程 本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎 动物的血液来分离血红蛋白。 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的 分离纯化，洗涤次数不可过少。 1、采集血样。2、低速短时间离心 （速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一 同沉淀，达不到分离的效果）3、吸取血浆：上层透明 的黄色血浆。4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为 0.9％的氯化钠溶液洗涤。5、低速离心（低速短时间） 6、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表 明洗涤干净。 加蒸馏水到原血液体积，再加 40％体积的甲苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌10 分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。 装配好的凝胶柱 让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能。 血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察 颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程 非常直观，大大简化了实验操作。 2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱 柱装填得成功吗？你是如何判断的？ 由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支 与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可 以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖， 观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色 谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体 以消除气泡，消除不了时要重新装柱。 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的 话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随 着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分 离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。 1.凝胶色谱法分离蛋白质的的原理是怎样的? 2.什么是缓冲溶液?它的作用是什么? 3.电泳的作用及其原理是什么? 4.你能描述血红蛋白分离的完整过程吗? 5.与其他真核细胞相比,红细胞有什么特点?这一特点对你进行 蛋白质的分离有什么意义? 旁栏思考：你能从凝胶色谱的分离原理分析为什 么凝胶的装填要紧密、均匀吗？ 答：凝胶实际上是一些微小的多孔球体，小球体内部 有许多贯穿的通道。相对分子质量较大的蛋白质分子 不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过 的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋 白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较 长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大 的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出， 相对分子质量最小的分子最后流出，从而使各种相对 分子质量不同的分子得以分离。如果凝胶装填得不够 紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本 该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱 洗脱液的流动次序，影响分离的效果。 血红蛋白是有色蛋白，因此在 凝胶色谱分离时可以通过观察颜色 来判断什么时候应该收集洗脱液。 这使血红蛋白的分离过程非常直观， 大大简化了实验操作。 练习巩固 1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋 白质的研究和应用越来越深入，首先要 做的一步是： A 弄清各种蛋白质的空间结构。 B 弄清各种蛋白质的功能。 C 弄清各种蛋白质的合成过程。 D 获得高纯度的蛋白质。 2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中， 关于蛋白质的叙述，正确的是： A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于 相对分子质量较大的蛋白质。 B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于 相对分子质量较大的蛋白质。 C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于 相对分子质量较大的蛋白质。 D 二者根本无法比较。 3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不 同蛋白质的电泳迁移率完全取决于： A 电荷的多少 B 分子的大小 C 肽链的多少 D 分子形状的差异 4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是： A 调节pH B 维持红细胞的能量供应 C 防止微生物生长 D 防止血液凝固 5、一分子血红蛋白最多可携带的 O2分子数 和CO2分子数分别是 A 4、2 B 4、4 C 2、1 D、1、1 6、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后 分层顺序自上而下是： 有机溶剂-----脂类物质-----血红蛋白溶液----- -红细胞破碎物沉淀。 教学反馈 1．凝胶色谱法是根据（ ）分离蛋白质的有效方法。 A分子的大小 B相对分子质量的大小 C带电荷的多少 D溶解度 2．缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来 维持（ ）基本不变。 A温度 B pH C渗透压 D氧气浓度 3．电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷 （ ）的电极移动。 A相同 B相反 C相对 D相向 4. 哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（ ）与氧气的 运输有关。 A血红蛋白 B肌红蛋白 C肌动蛋白 D肌球蛋白 B B B A 5．血液由血浆和各种血细胞组成，其中（ ） 的含量最多。 A白细胞 B血小板 C红细胞 D淋巴细胞 6．为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗 凝血剂（ ）。 A. NaCl B.甲苯 C.蒸馏水 D.柠檬酸钠 7．将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后， 可以明显看到试管中的溶液分为4层， 其中第3层是（ ） A无色透明的甲苯层 B脂溶性物质的沉淀层 C血红蛋白的水溶液 D其他杂质的暗红色沉淀物 C D C