高中生物竞赛：第06章细菌的遗传分析课件共65张

第六章 细菌的遗传分析 本章重点： 细菌杂交 转化和转导 学时数： 3-4学时 细菌的细胞和基因组 • 细菌细胞 l 比较小，有细胞壁 l 拟核（nucleoid） l 无真核细胞特有的细胞器 • 细胞分裂就是生长繁殖 细菌的分裂 细菌的基因组 • 细菌染色体 l 细菌染色体大多为裸露的环状闭合DNA双链，没有 组蛋白和其他蛋白质结合，也不形成核小体结构。 l （这种结构有利于外源DNA的插入。） • E.coli基因组概况 l E.coli的染色体为闭合双链环状DNA，长约1333um. l 2001年10月15日完成了E.coli K12菌株的基因组全 序列测定。总共4639221 bp， 4279个蛋白质编码 基因，115个编码rRNA和tRNA的基因。（GenBank编 号:U00096） E.coli基因组 注释图（部分） 彩框表示编码 蛋白质的基因。 大肠杆菌的突变型及筛选 细菌可以在人工培养基上培养，形成的群体称为菌落。 colony 基本培养基和完全培养基； 野生型（原养型）和突变型 Wild-type mutant 枯草芽孢杆菌的菌落  大肠杆菌的突变型 • 合成代谢功能的突变型 Anabolic functional mutants • 分解代谢功能的突变型 catabolic functional mutants • 抗性突变型 resistant mutants 大肠杆菌基因符号的命名 • Demerec 法则 • 规定： 表型（首字母大写，正体） Gal+ ，Gal-；Tetr，Tets 基因型 （斜体） gal+ gal- ；tetr tets - 表示缺陷型或突变型 相同表型的不同基因突变（基因座）则在3字母后加 大写字母，如metA， metB，…… 细菌中常用的突变型基因符号 ara 阿拉伯糖不能利用 mtl 甘露糖醇不能利用 arg 精氨酸缺陷型 pdx 吡多醇缺陷型 att 原噬菌体附着点 phe 苯丙氨酸缺陷型 ade 腺嘌呤缺陷型 pro 脯氨酸缺陷型 azi 叠氮化钠抗性 pur 嘌呤缺陷型 bio 生物素缺陷型 pyr 嘧啶缺陷型 cys 胱氨酸缺陷型 rha 鼠李糖不能利用 gal 半乳糖不能利用 str 链霉素抗性 his 组氨酸缺陷型 thi 硫胺缺陷型 lac 乳糖不能利用 thr 苏氨酸缺陷型 leu 亮氨酸缺陷型 ton phageT1抗性 lys 赖氨酸缺陷型 trp 色氨酸缺陷型 mal 麦芽糖不能利用 tsx phageT6抗性 man 甘露糖不能利用 tyr 酪氨酸缺陷型 met 甲硫氨酸缺陷型 xyl 木糖不能利用 ara mtl arg pdx att phe ade pro azi pur bio pyr cys rha gal str his thi lac thr leu ton lys trp mal tsx man tyr met xyl 大肠杆菌的突变型的筛选 • 分解功能突变型 l Media中加入呈色底物，利用分解产物与底 物的反应或不反应 • 抗性突变型 l Media中加入抗生素或phage • 合成功能突变型(营养缺陷型) l 用影印培养或点种法 影印培养 点种法 诱变后培养在完全培养基上，缺陷型和野生 型都能生长 点种于含单一营养物质的基本培养基上 如果在所有平板上都 能生长，是野生型； 只在其中一个平板上 生长的，就是所加营 养物质的缺陷型 大肠杆菌的杂交 接合（conjugation） 细菌的杂交 1946，Lederberg和Tatum用 A菌株 met- bio- thr+ leu+ thi+ B菌株 met+bio+ thr- leu- thi- 做混合培养，涂基本培养基平板，长出了几 十个菌落，发生频率为10-7 表明met+ bio+ thr+ leu+ thi+组合到同一细胞中 A B 完全液体培养基 基本固体培养基平皿 野生型从何而来？ • 回复突变？ • 转化？ • 营养互补？ • 基因重组？ 突变率一般为2×10-7 ， 两个基因同时突变4 ×10-14 三个基因同时突变8 ×10-21 × U型管试验 滤器孔径极小，保证细胞不能通过， 避免细胞接触。 分别培养A、B菌株，通气保证培 养液物质交换。 分别涂平板， 都没有菌落生长。 结论 • A、B菌株有细胞接触，并发生了重组。 • 不同品系的大肠杆菌可以杂交(接合)，并 进行基因重组。 杂交时的贡献 • Hayes发现，两个菌株在杂交时贡献不 一样 l A(strr)与B(strs) l A(strs)与B(strr) l 在不含str的基本培养基上都能得到菌落 l 但在含str的基本培养基上，只有A(strs)与 B(strr)能得到菌落，说明遗传物质是单向转 移的过程 大肠杆菌的性别 • 在杂交中提供遗传物质的A菌株相当于雄 性，记作F+，因为在细胞中有F因子 • 接受遗传物质的B菌株相当于雌性，记作 F-，在细胞中没有F因子 F因子 F factor/element 细菌染色体之外的能独立增殖的环状DNA， 含形成性伞毛的基因。又称性因子(sex factor)或致育因子(fertility factor)，可 以转移。约6×104bp，约为E.coli染色体 的2% 配对区域(pairing region) 致育基因 (fertility gene) 原点(origin) 质粒、附加体 质粒plasmid：指染色体外的遗传物质，可以 自我复制，并在细胞分裂时分配到子细胞中。 附加体episome：有些质粒除了可在染色体外 自我复制外，还可以整合到细菌染色体上，成 为细菌染色体的一部分，随着细菌染色体的复 制而复制。 F因子的结构 F因子 F+通过性伞毛与F-结合，传递遗传物质。 F-得到F因子变成F+; F+失去F因子变成F-。 F+ F-杂交通常只转移F因子，染色体上基因转 移的频率很小，不到10-6 高频重组 研究中发现，有一个菌株与F-杂交时， F- 很少转变成F+，但后代中重组子频率很 高，达到10-2， 这一菌株被称为高频重组菌株(high frequency recombination strain,Hfr菌株)。 Hfr细菌重组的特点 • F因子通常最后进入F-菌株， F-菌株得到 的往往是染色体片段，仍然为F-菌株。 • 部分二倍体(partial diploid) l 外基因子exogenote 供体提供的染色体片段 l 内基因子endogenote 受体本身的染色体 细菌的重组 Hfr菌株的进入F-菌株的不 完全的基因组（外基因 子exogenote）与F-的 染色体（内基因子 endogenote ）之间发 生交换。 部分二倍体（半合子merozygote）：指同时 具有内基因子和外基因子的细菌细胞。 F因子的整合与Hfr菌株的形成 在F因子和染色体上都有插入序列 （IS），当相互配对发生交换时， F因子就整合到染色体上。由于IS 在染色体上存在极性，整合后的F 因子的方向就确定了。 F+ 菌株 Hfr菌株 F因子的环出 • F-受体很少得到完整的F因子，因此大多数重 组子仍为F-。只有整条Hfr染色体都转移时，F- 才能得到完整的F因子,变成F+(Hfr)。 • 只有偶数次交换才能保证细菌染色体的完整性， 产生平衡的有活性的重组子；如果内外基因子 之间发生单交换，则环状染色体被破坏，产生 不平衡的部分二倍体线性染色体，不能复制， 细胞不能繁殖； 3）重组子只有一种类型， 相反的重组子 (reciprocal recombinant)不会出现。所以细菌 的交换不是一个交互过程，而是单向的。 中断杂交技术 Wollman 和 Jacob Hfr thr+ leu+ azir tonr lac+ gal+ strs × F- thr- leu- azis tons lac- gal- strr 混合培养，隔一段时间取样用搅拌器搅拌，稀 释涂平板（含str不含thr、leu，只有thr+ leu+ strr 的重组子才能生长）。 重组子用影印培养方法检定其他非选择性标记 基因 根据供体基因进入受体 细胞的顺序绘制连锁图的 技术 中 断 杂 交 试 验 示 意 图 影印培养 中断杂交作图 • 根据中断杂交结果判断不同基因进入受 体的顺序，并以时间和顺序作出基因连 锁图。 0 5 10 15 20 25 min O azi ton lac gal E.coli 的连锁群 F因子 大肠杆菌环状染色体的推测 用不同的Hfr菌株进行中断杂交试验得到不同的 连锁图。 Hfr H 0 thr azi lac tsx gal trp mal xyl met thi F Hfr C 0 tsx lac azi thr thi met xyl mal trp gal F Hfr J4 0 thi met xyl mal trp gal tsx lac azi thr F Hfr P72 0 met thi thr azi lac tsx gal trp mal xyl F 菌株H和P72顺序一致，只是起点不同 菌株C和J4正好与H和P72相反 大肠杆菌环状染色体的推测 F因子的插 入决定了 Hfr染色体 的极性，F 因子位于末 端，相对的 是原点（转 移起始位点） 大肠杆菌的遗传学图 大肠杆菌全部 染色体转移需 要90min。 52个准确定位 的基因座位， 五六百个初步 定位。 重组作图 中断杂交技术得出的基因连锁关系是以时间为单 位的，当时间单位在两分钟时，所测得的图距 就不准确了。必须用重组作图。 Hfr lac+ ade+ strs × F- lac- ade- strr 已知ade在lac之后转移，lac和 ade间的图距为1分钟。 在不含ade的str平板上筛选重组子ade+ strr （ lac+ 也转移） EMB平板（伊红美蓝培养基） lac+菌落为紫红色，表明lac 和ade间无交换 Lac-菌落为粉红色，表明lac 和ade间有交换 F’菌株 1959年，Adelberg发现， 用一菌株（Hfr）×F- 可以高频率地转移特定的基因和育性。 F’因子 • 含有某一小段染 色体基因的F因子 • 可能带有不同的 细菌基因 • 与缺陷型噬菌体 不同，本身的基 因并不减少。 F’菌株 • 含有F’因子的细菌，可以借整合形成Hfr， 介于F+和Hfr之间。 • 能正常转移，使受体转变为F’，并在受 体细菌中形成部分二倍体。 杂交过程中遗传物质的转移 F+lac+ F-lac- F-lac-F+lac+ F’lac+ F-lac- 性导 • 性导Sexduction： F’因子转移后可形成 部分二倍体的过程。通过性导可以转移 细菌的特定基因。也可以将受体菌株变 为F’菌株。 • 性导的研究用途 l F’因子在受体中能自主复制传递 l 可以用作不同突变型间的互补测验 l 确定部分二倍体中“等位”基因的显隐性关 系 l 利用不同的F’因子性导来测定不同基因在一 起性导的频率进行作图 F、F`和Hfr菌株的关系 吖黄素 F+ F- Hfr F+ F- F+ F- 结合 高频重组低频重组 整合 F’ F’ 重组频率较低 Hfr转移细菌染色体的频率高， 而F因子很少进入受体。 F’ 和F容易转移使F-变成F+或F’ ， 但细菌染色体很少进入。 转化与转导 • 转化(transformation) • 转导(transduction) 谁先发现了细菌转化现象？ 细菌的转化与作图 • 转化频率低，通常为1% l 受体表面的允许DNA通过的受体位点(receptor site)是有限的 l DNA的进入还需要酶或pr以及能量的协同作用 • 感受态细胞(competence cell)：能接受外 源DNA分子并被转化的细菌细胞。 细菌转化的过程 • 转化时DNA片段约20kb，进入受体后形 成部分二倍体，一旦重组就可以使受体 发生稳定的性状 l DNA 分子与细胞表面受体部位结合 l DNA片段进入细胞 l 一条单链被降解，剩单链DNA l 单链DNA插入受体的DNA链中，形成部分杂 合的DNA分子 l 经复制、重组、分离后，形成各种类型的转 化子(transformants) 细菌的转化 • 供体DNA片段可以携带多个基因，可能 同时转化 • 但同时转化的基因不一定连锁，因为可 能有2个或多个片段进入细胞 • 连锁基因共转化和非连锁基因共转化的 频率不同，但DNA浓度降低时，非连锁 基因共转化的频率比连锁基因共转化频 率低 细菌的转化与作图 • • 未转化类型不能作为亲本型，如计算trp2 和his2时，+++和++tyr1是亲本型，而 trp2his2+不统计。 trp2 his2 tyr1 34 13 40 转染 • Transfection，是转化的特殊方式，指用 裸露的噬菌体DNA感染细菌并使其在细 菌中表达。 • 用真核细胞为受体时，任何裸露DNA的 吸收都称为转染。 转导与作图 • 转导transduction：以噬菌体为媒介,将 细菌的染色体片段或基因从一个细菌转 移到另一个细菌。 转导的发现 Lederberg和学生zinder研究沙门氏菌杂 交时，基本培养基上出现10-5的野生型， 发现U型管试验也得到10-5的野生型，表 明隔开也能产生重组类型。 普遍性转导(generalized transduction) 后来证实是由温和噬菌体P22引起的。 普遍性转导的频率较低,约为10-5,相距较远(超过 phage包装大小)的两个基因同时转导的频率则更低, 仅有10-5 10-5=10-10 定义：P1、P22等噬菌体可以转移细菌染色体的 许多不同部分，称为普遍性转导 普遍性转导 决定噬菌体感染能力的是噬菌 体的蛋白质外壳 普遍性转导 • 约0.3%的子代噬菌体为转导噬菌体，而 被包装入噬菌体头部的DNA片段约为细 菌基因组的1%，所以转导频率一般为 3×10-5 共转导cotransduction • 两个或以上基因一起转导进受体 • 两个基因共转导频率越高，表明两个基 因连锁越紧密；共转导频率低则表明两 个基因距离远。 共转导 P1噬菌体 供体菌：thr+leu+azir 受体菌： thr-leu-azis 选择标记 非选择标记 1 leu+ 2% thr+ 50%azir 2 thr+ 3%leu+ 0azir 3 thr+leu+ 0azir thr leu azi 由于thr-leu的长度正好为噬菌体染色体的大小，所以 thr+leu+ 转化子并不转移azir 共转导 • 同染色体上2个基因间的物理距离： d = L(1- 3 x ) 其中：d表示2个基因间图距 L表示转导的DNA长度 x表示2个基因共转导频率 流产转导abortive transduction • 只有10%的转导能发生重组，形成完全 转导，长成正常菌落。 • 90%的转导只将供体基因导入受体，不 能重组，因而不能复制，进入一个子代 细胞中。靠母细胞中该基因的产物，子 代细胞可以分裂1-2次，形成小菌落。被 称为流产转导。 特异性转导、局限性转导 指噬菌体等只转移细菌染色体的特定部分。 K12()gal+ 经紫外诱导后感染gal-能得到gal+重组子 但有时不稳定，会恢复成gal- 特点：1.由缺陷噬菌体（记为 -dgal+）引起 2.外壳完整，可感染但不引起裂解 3.  -dgal+感染gal-，产生的多为部分二倍体， 能分离出gal-细胞。 特异性转导示意图 接合、转化与转导 • 共同点： l 单向转移 l 产生部分二倍体 l 外源基因整合后稳定遗传 • 不同点： l 接合需要不同育性的菌株接触；转化需要 DNA；转导需要噬菌体做媒介 The end 作业 •