专题2 微生物的培养与应用
课题2.3 分解纤维素的微生物的分离
一、【课题目标】
（一）知识与技能
简述纤维素酶的种类及作用，从土壤中分离出分解纤维素的微生物；掌握从土壤中分离某种特定微生物的操作技术
（二）过程与方法
分析分离分解纤维素的微生物的实验流程，弄懂实验操作的原理
（三）情感、态度与价值观
领悟科学探究的方法，发展科学思维和创新能力
二、【课题重点】
从土壤中分离分解纤维素的微生物
三、【课题难点】
从土壤中分离分解纤维素的微生物
四、【教学方法】
启发式教学
五、【教学工具】
多媒体课件
六、【教学过程】
（一）引入新课
上节课我们探讨学习了土壤中尿素分解菌的分离与计数，这节课我们以纤维素分解菌的分离与纯化为例，巩固加深对这方面技术的理解和掌握。
（二）进行新课
1．基础知识
活动1：阅读“纤维素与纤维素酶”，回答下列问题：
1．1纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。
延伸：草食性动物是怎样消化食物中纤维素的？肠胃中的共生物生物。
1．2棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。纤维素的分解需要在纤维素酶的催化作用下完成，请完成下列过程：
纤维素
纤维二糖
葡萄糖
C1酶、Cx酶
葡萄糖苷酶
〖思考1〗实验分析：P27的小实验是如何构成对照的？
在一支试管中添加纤维素酶，另一支试管不添加纤维素酶；尽管醋酸－醋酸钠缓冲液用量不同，但都能维持相同的pH。
〖思考2〗1个酶活力单位是指在温度为 25 ℃，其它反应条件最适宜情况下，在 1 min内转化 1mmol 的底物所需要的酶量。
活动2：阅读“纤维素分解菌的筛选”，回答下列问题：
1．3筛选纤维素分解菌的方法是刚果红染色法。该方法可以通过颜色反应直接筛选。
2．4其原理是：刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物无法形成，出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
2．实验设计
活动3：完成实验方案流程图，讨论回答问题：
5
选择培养
梯度稀释
涂布到鉴别纤维素分解菌培养基上
微生物培养
土壤取样
挑选产生透明圈的菌落
纯化培养
〖思考3〗实验流程中“选择培养”的培养基类型是什么？该培养的目的是什么？
液体选择培养基。其目的是使纤维素分解菌增殖，含量增多。
〖思考4〗本实验流程与尿素分解菌的分离实验流程有哪些异同？
尿素分解菌的分离实验流程是将土样制成的菌悬液直接涂布在选择培养基上；本课题通过选择培养使细菌增殖后，再涂布在鉴别培养基上。其它操作基本基本共同。
活动4：阅读资料一“土壤取样”，回答下列问题：
2．1纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中。
2．2为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？
生物适应一定环境，环境对生物具有选择作用，只有在纤维素含量丰富的环境中纤维素分解菌的含量才会高于其它普通环境，从而提高获得目的微生物的几率。
2．3将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？
人工设置适宜环境，使纤维素分解菌相对聚集。将纸埋于深约10cm的腐殖土壤中。
活动5：阅读资料二“选择培养基”，回答以下三个问题：
2．4纤维素分解菌选择培养基属于液体培养基，原因是没有添加琼脂成分。
2．5培养基选择作用机制是以纤维素粉为唯一碳源，只有纤维素分解菌才能生存。
2．6若设置一个对照实验说明选择培养的作用，应控制的变量是将纤维素粉改为葡萄糖。
活动5：阅读资料三“刚果红染色法”，填表比较两种染色法的各自的优缺点：
染色法
优点
缺点
方法一
颜色反应基本上是
纤维素分解菌的作用
操作繁琐
刚果红会使菌落之间发生混杂
方法二
操作简便
不存在菌落混杂问题
产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈，
有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。
〖思考5〗为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？
在选择培养条件下，可使能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。
3．结果分析与评价
活动6：阅读“课题延伸”，回答：
3．1为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行 发酵产纤维素酶 实验，纤维素酶的发酵方法有 液体 发酵和 固体 发酵。
3．2纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的 葡萄糖 含量进行定量测定。
纤维素分解微生物的分离
纤维素酶
种类、作用、最适pH、催化活力
刚果红染色
筛选原理
实验设计
土壤取样
选择培养
涂布培养
纯化培养
前置染色法
后置染色法
富含纤维素土壤
增大分解菌含量
染色鉴别
分离出分解菌
（三）课堂总结、点评
（四）实例探究
例1．有关谷氨酸发酵的叙述中正确的是
5
A．发酵中要不断通入空气 B．培养条件不当将不能得到产品
C．搅拌的唯一目的是使空气成为小泡 D．冷却水可使酶活性下降
解析：进行谷氨酸发酵的菌种是异养需氧型微生物，所以要在培养过程中不断通入空气，但是必须通入的是无菌空气，普通空气是不行的，容易造成杂菌污染。搅拌不但使空气成为小气泡以增加培养基中的溶氧量，还能使培养基与菌种充分接触，提高原料的利用率。在培养过程中，由于微生物的代谢产热和机械磨擦生热，会使培养基的温度升高，高到一定程度，就会使酶的结构和核酸的结构遭到破坏，培养会因此而受到影响。降低温度，是保证酶正常活性的条件之一而不会使酶的活性下降。当培养条件不恰当时，不能得到谷氨酸。如pH降低时将得到乙酰谷氨酰胺，溶氧低时将得到乳酸或琥珀酸。
答案：B
例2．温度对发酵过程的影响，不正确的是
A．温度过高，发酵周期缩短，产量降低 B．温度不影响生物合成的途径
C．温度能影响菌种对营养物质的吸收
D．菌体生长和产物合成所需的最适温度不一定相同
解析：解答此题需要从以下几方面入手分析：第一，发酵过程需要适宜的温度，如果温度过高，酶很快失活，菌体衰老，发酵周期就会缩短，产量也会降低；第二，温度能影响生物合成的途径，这是因为生物合成过程需要酶，酶的活性与温度高低有关；第三，菌种吸收营养物质一部分是通过主动运输来完成的，需呼吸作用提供能量，这与温度有关；第四，菌体生长和产物合成需体内旺盛的代谢作基础，而用于生长繁殖和代谢产物生成的酶不同，因此所需的最适宜的温度也不一定相同。
答案：B
☆综合应用
例3、淀粉酶可以通过微生物发酵生产，为了提高酶的产最，请你设计一个实验，利用诱变育种方法，获得产生淀粉酶较多的菌株。①写出主要实验步骤。②根据诱发突变率低和诱发突变不定向性的特点预期实验结果。
提示：生产菌株在含有淀粉的固体培养基上，随其生长可释放淀粉酶分解培养基中的淀粉，在菌落周围形成透明圈。（2004天津理科综合能力测试）
解析：这是一道以诱变育种、选择培养和鉴别培养等知识为载体的实验设计题，综合性强，难度较大。既要求学生掌握实验原理，也要求学生具备较强的实验设计的能力及对实验结果的预测和分析能力。
答案：
①主要实验步骤：
第一步：将培养好的生产菌株分两组。一组用一定剂量的诱变剂处理，另一组不处理做对照。
第二步：制备含淀粉的固体培养基。
第三步：把诱变组的大量菌株接种于多个含淀粉的固体培养基上，同时接种对照组，相同条件下培养。
第四步：比较两组菌株菌落周围透明圈的大小，选出透明圈变大的菌株。
②预期实验结果：
a．由于诱发突变率低，诱变组中绝大多数菌落周围的透明圈大小与对照组相同。
b．由于诱发突变不定向性，诱变组中极少数菌落周围的透明圈与对照组相比变大或变小。
（五）巩固练习
1．下面是弗来明对青霉素的早期研究过程：
发现问题：在培养细菌的器具中发现一种青霉菌，在这种青霉菌的周围有没有其它细菌生存?为什么会产生这种现象?
提出假设：
设计实验：在液体中培养青霉菌后，考察这种液体对细菌增殖的影响。
实验结果：培养液使细菌的增殖停止。
结论：下面几项最适合作为该实验假设的是
A．青霉菌与细菌之间是共生关系 B．青霉菌污染了细菌生存的环境
C．青霉菌产生了对人体有益的物质 D．青霉菌能产生抑制细菌增殖的物质
2．培养流感病毒时，应选用
A．固体培养基 B．含有多种无机盐的培养液
C．活的鸡胚 D．无菌的牛肉汤
5
3．以下关于微生物对氧的需求的叙述中正确的是
A．产甲烷杆菌属厌氧呼吸，但氧的存在不影响其生存
B．链球菌进行厌氧呼吸，不能接触空气
C．黄色短杆菌在氧气充足时才能产生谷氨酸
D．谷氨酸棒培育杆菌是厌氧呼吸
4．可以使微生物细胞内蛋白质、核酸发生不可逆破坏的环境加素是
A．高温 B.营养成分的变化 C.氧含量 D.温度、pH、氧的共同作用
5．微生物（除病毒外）需要从外界吸收营养物质并通过代谢来维持正常的生长和繁殖。下列有关微生物营养的说法正确的是
A．乳酸菌与硝化细菌所利用的碳源物质是相同的
B．微生物生长中不可缺少的一些微量的无机物称为生长因子
C．培养基中的营养物质浓度越高对微生物的增殖越有利
D．生长因子一般是酶或核酸的组成成分，微生物本身合成这些生长因子的能力往往不足
6．下列有关味精生产的一些措施的叙述，正确的是
A．常用的菌种是谷氨酸棒状杆菌和金黄色葡萄球菌
B．培养基是含有五种营养成分的合成培养基
C．在发酵中要控制的只是温度、pH、通气量
D．味精是谷氨酸经Na2CO3中和后，再经过过滤、浓缩、离心分离而成
7．菌落形成的根本原因是
A．细菌有鞭毛 B．细菌能运动
C．培养基有琼脂 D．子细胞成为群体
8．在接种操作的过程中，不正确的是
A．要将接种环灼烧灭菌 B．取下棉塞后要将试管口灼烧灭菌
C．将接种环伸入试管内，先接触长菌多的部位 D．接种后还要将管口灭菌加塞
9．高压蒸气灭菌的原理是
A．高压使细菌DNA变性 B．高压使细菌蛋白质凝固变性
C．高温烫死细菌 D．高温使细菌DNA变性
10．某种细菌每30分钟分裂一次，开始接种时为3个细胞，在对数生长期培养5个小时后，问此时有多少细胞？
A．15 B．48 C．1024 D．3072
答案：1—5 DCCAD 6—10 DDCBD
七、【课余作业】
1、为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？
2、将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深
八、【教学体会】
教材在介绍刚果红染色法之前，首先用“筛子筛沙”这一形象的比喻来说明筛选微生物的基本思想方法。在教学过程中可以结合专题2介绍的选择培养基的内容，进一步引导学生深入认识分离微生物的基本思想。刚果红染色法的知识难度并不大，学生通过自学就能够理解。
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九、【资料袋】
两种刚果红染色法的比较
刚果红在筛选纤维素分解菌上的应用已经有超过20年的历史，在本课题中我们给出了两种方法。方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；其优点是这样显示出的颜色反应基本上纤维素分解菌的作用。方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂的问题，缺点是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊，因为培养基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分。方法二的另一缺点是：有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。
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