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专题十五 生物技术实践
1．某研究小组尝试制作蓝莓果酒和蓝莓果醋，并探讨提取花青素的方法。请回答下列问题：
(1)为提高果酒的品质，需先获得纯净的酵母菌菌种。吸取1mL酵母菌样液，在105稀释倍数下统计各平板上生长的平均菌落数为32，涂布时所用稀释液体积为0.1mL，则每mL样液中的菌株数＝__3.2×107__个。
(2)酿制蓝莓果酒前不需要对蓝莓进行严格的消毒以除去杂菌，这是因为在__缺氧、呈酸性__条件下，绝大多数微生物因无法适应这一环境而受抑制。发酵时一般要先通气，其目的是__酵母菌可在有氧条件下大量繁殖__。果汁发酵后是否有酒精产生，可在酸性条件下用橙色的__重铬酸钾__进行检验，若溶液颜色变成__灰绿色__证明有酒精存在。
(3)酿制成功的蓝莓果酒如果暴露在空气中酒味会逐渐消失而出现酸味，尤其是气温高的夏天，其原因是__醋酸菌在有氧条件下，产生大量醋酸(合理叙述给分)__。
(4)查阅资料得知，花青素是水溶性色素。在pH小于3.0条件下比较稳定，在60℃以下热稳定性较好。溶剂萃取法是最常用提取方法，萃取剂宜选用__乙醇__(乙醇/乙醚)，将萃取相关过程的pH控制在__3__左右可有效地保障萃取成功。
[解析] (1)为提高果酒的品质，需先获得纯净的酵母菌菌种。吸取1 mL酵母菌样液，在105稀释倍数下统计各平板上生长的平均菌落数为32，涂布时所用稀释液体积为0.1 mL，则每mL样液中的菌株数＝32÷0.1×105＝3.2×107个。(2)酿制蓝莓果酒前不需要对蓝莓进行严格的消毒以除去杂菌，这是因为在缺氧、呈酸性条件下，绝大多数微生物因无法适应这一环境而受抑制。发酵时一般要先通气，其目的是酵母菌可在有氧条件下大量繁殖。果汁发酵后是否有酒精产生，可在酸性条件下用橙色的重铬酸钾进行检验，若溶液颜色变成灰绿色证明有酒精存在。(3)酿制成功的蓝莓果酒如果暴露在空气中酒味会逐渐消失而出现酸味，尤其是气温高的夏天，其原因是醋酸菌在有氧条件下，产生大量醋酸。(4)花青素是水溶性色素。在pH小于3.0条件下比较稳定，在60℃以下热稳定性较好。溶剂萃取法是最常用提取方法，萃取剂宜选用乙醇，将萃取相关过程的pH控制在3左右可有效地保障萃取成功。
2．(2018·河北省衡水中学一模)为了分离和纯化高效分解石油的细菌，科研人员利用被石油污染过的土壤进行如图A所示的实验。请回答下列问题：
(1)配制好的培养基通常使用__高压蒸汽灭菌__法灭菌。步骤③与步骤②中培养基成分相比，最大的区别是__步骤③的培养基中石油是唯一碳源__。
(2)同学甲进行步骤④的操作，其中一个平板经培养后的菌落分布如图B所示。该同学的接种方法是__稀释涂布平板法__，出现图B结果可能的操作失误是__涂布不均匀__。
(3)同学乙也按照同学甲的接种方法进行了步骤④的操作：将1
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mL样品稀释100倍，在3个平板上分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为56、58和57。据此可得出每升样品中的活菌数为__5.7×107__个。
(4)步骤⑤需要振荡培养，原因是__使石油分布均匀，与细菌充分接触，有利于细菌的繁殖(答案合理即可)__。
(5)步骤⑤后取样测定石油含量的目的是__筛选出分解石油能力最强的细菌__。
[解析] (1)培养基的灭菌方法常采用高压蒸汽灭菌法。步骤③的培养基中石油是唯一的碳源，步骤②会有其他有机物作为碳源。(2)图B中的菌落不是呈线形分布，所以采用的接种方法应是稀释涂布平板法。图B中的菌落分布不均匀，应是操作中涂布不均匀引起的。(3)三个平板中的菌落数分别是56、57、58，取平均值得57，每升样品中的活菌数目＝57×10×100×1000＝5.7×107(个)。(4)步骤⑤应进行振荡培养，其目的是使加入的石油分布均匀，石油与细菌充分接触，有利于细菌的繁殖。(5)步骤⑤后取样测定石油的含量，可以得到被细菌分解的情况，如果含石油越少，则说明细菌分解的石油越多，这样可以筛选出分解石油能力最强的细菌。
3．我国最早的诗集《诗经》中有“田中有庐，疆场有瓜是剥是菹”的诗句，其中“庐”和“瓜”是蔬菜，“剥”和“菹”是腌制加工的意思。泡菜是一种历史悠久、深受群众喜爱的传统美食。某兴趣小组的同学进行了制作泡菜的实践活动。
回答下列问题：
(1)按清水与盐质量比为4︰1的比例制好盐水后，需将盐水煮沸，其作用是__除去盐水中的氧气和杀菌__。
(2)为测定泡菜中亚硝酸盐含量，首先要配制__亚硝酸盐__标准显色液，并与样品进行比较。泡菜制作的第3～5天亚硝酸盐含量较高不宜食用，原因是__适宜的pH、温度和一定微生物作用下亚硝酸盐转变成致癌物质亚硝胺__。
(3)若将稀释105倍的某细菌菌液，用直接计数法和稀释涂布平板法进行计数。
①直接计数法：用吸管吸取0.1 mL该菌液，滴于血球计数板上的__盖玻片__边缘，待该细菌全部沉降到计数室底部，用显微镜直接计数。并计算出每升菌液的细菌数目。
②稀释涂布平板法计数：在五个固体培养基上分别接种0.1 mL该细菌菌液，适宜条件下培养一段时间后，培养基上的菌落数分别为：20、40、152、154、156，则每升菌液中细菌数量为__1.255×1011__个。
③正常操作情况下，上述两种计数法中，__直接计数法__统计获得的数目偏多，原因是__直接计数法无论菌体死活均被计数，而稀释涂布平板法当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落(合理答案给分)__。
[解析] (1)按清水与盐质量比为4︰1的比例制好盐水后，需将盐水煮沸，其作用是除去盐水中的氧气和杀菌。(2)为测定泡菜中亚硝酸盐含量，首先要配制亚硝酸盐标准显色液，并与样品进行比较，泡菜制作的第3～5天亚硝酸盐含量较高不宜食用，原因是适宜的pH、温度和一定微生物作用下亚硝酸盐转变成致癌物质亚硝胺。(3)若将稀释105倍的某细菌菌液，用直接计数法和稀释涂布平板法进行计数。①直接计数时，应先盖盖玻片，再在盖玻片的边缘滴加培养液。②
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稀释涂布平板法计数时，为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数，因此每升菌液中细菌数量＝(40＋154＋156＋152)÷4÷0.1×105×103＝1.255×1011个。③由于直接计数法无论菌体死活均被计数，而稀释涂布平板法当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，上述两种计数法中，直接计数法统计获得的细菌数量偏多，而稀释涂布平板法统计获得的细菌数量偏少。
4．(2018·东北三省三校一模)为了对柑橘综合利用，某研究人员做以下实验：
请回答以下问题：
(1)橘皮精油__无__色，主要成分是__柠檬烯__。本实验用到的植物芳香油提取方法为__水蒸气蒸馏和压榨__。
(2)若要计算提取精油的出油率，需要称量__芳香油和原料__的质量。对比发现方法1的出油率稍低，但是发现其香气、色泽更接近于鲜橘，原因是方法2会使__原料焦糊和有效成分水解__，所以通常先采用方法1提取，并将方法1之后的残渣用方法2进一步提取。
(3)通常使用方法1时，可以提前使用__石灰水__浸泡。浸泡的时间通常是__10h__以上。
(4)使用方法2提取时发现，柑橘皮的破碎度越高，即颗粒越小，出油率越高，原因是__原料(相对表)面积大，随水蒸汽蒸馏速度快。(与溶剂接触的面积越大)(橘皮香精油从果皮内部逐渐扩散至固体表面所通过的距离越短，故容易渗出。)__。
[解析] (1)橘皮精油无色，主要成分是柠檬烯。本实验用到的植物芳香油提取方法为水蒸气蒸馏和压榨。(2)若要计算提取精油的出油率，需要称量芳香油和原料的质量。对比发现方法1的出油率稍低，但是发现其香气、色泽更接近于鲜橘，原因是方法2会使原料焦糊和有效成分水解。(3)通常使用方法1时，用石灰水浸泡柠檬皮可破坏细胞结构，分解果胶，防止压榨时滑脱，提高出油率。浸泡的时间通常是10h以上。(4)使用方法2(水蒸气蒸馏法)提取时发现，柑橘皮的破碎度越高，即颗粒越小，出油率越高，原因是原料(相对表)面积大，随水蒸汽蒸馏速度快。
5．大肠杆菌是与我们日常生活联系非常密切的细菌，请回答有关检测饮用水中大肠杆菌的问题：
(1)检测饮用水中大肠杆菌的含量时，通常将样品进行一系列的梯度稀释，将不同稀释度的水样用涂布器分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养，然后记录菌落数量，这种方法称为__稀释涂布平板法__。判断下图所示的4个菌落分布图中，不可能是用该方法得到的是__D__。
(2)用上述方法统计样本中菌落数时是否需要设置对照组？__需要__，其原因是需要判断培养基__是否被杂菌污染(灭菌是否合格)__，对于固体培养基应采用的检测方法是将__未接种__的培养基在适宜的温度下放置一段时间，观察培养基上是否有菌落产生。
(3)在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养器皿进行__灭菌
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__(填“消毒”或“灭菌”)处理；操作者的双手需要进行清洗和__消毒__；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使其内蛋白质变性，还能损伤它的__DNA__的结构。
(4)检测大肠杆菌实验结束后，使用过的培养基及其培养物必须经过__灭菌__处理才能丢弃，以防止培养物的扩散。
[解析] D中菌落分布情况为利用平板划线法所得。为判断培养基灭菌是否合格，本实验需要设置对照。要判断固体培养基是否被污染，可将未接种的培养基在适宜的温度下培养一段时间，若发现有菌落说明培养基已被污染。消毒是指使用较温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)。灭菌是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。对人的手不能进行灭菌处理。对培养基和培养器皿要进行灭菌处理，对操作者的双手需要进行清洗和用酒精消毒。
6．(2018·全国卷Ⅲ)回答下列与酵母菌有关的问题：
(1)分离培养酵母菌通常使用__麦芽汁琼脂__(填“牛肉膏蛋白胨” “MS”或“麦芽汁琼脂”)培养基，该培养基应采用__高压蒸汽__灭菌法灭菌。若将酵母菌划线接种在平板上，培养一段时间后可观察到菌落，菌落的含义是__由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体__。
(2)酵母菌液体培养时，若通入氧气，可促进__菌体快速增殖__(填“菌体快速增殖”“乙醇产生”或“乳酸产生”)；若进行厌氧培养，可促进__乙醇产生__(填“菌体快速增殖”“乙醇产生”或“乳酸产生”)。
(3)制作面包时，为使面包松软通常要在面粉中添加一定量的酵母菌，酵母菌引起面包松软的原因是__酵母菌分解葡萄糖会产生CO2，CO2使面包松软__。
[解析] (1)牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用广泛的细菌培养基；MS培养基是满足植物细胞的营养和生理需要的培养基；麦芽汁琼脂培养基通常用于酵母菌(真菌)的培养、鉴定及菌种保存。培养基的灭菌方法为高压蒸汽灭菌法。菌落是指由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。
(2)酵母菌为兼性厌氧型微生物，在有氧条件下进行有氧呼吸为酵母菌的繁殖提供能量，在无氧条件下，酵母菌进行无氧呼吸产生乙醇。
(3)面包松软是因为制作过程中加入的酵母菌可以分解葡萄糖产生大量的CO2，CO2遇热膨胀，使得制作的面包松软多孔。
7．(2018·江苏卷)酵母的蛋白质含量可达自身干重的一半，可作为饲料蛋白的来源。有些酵母可以利用工业废甲醇作为碳源进行培养，这样既可减少污染又可降低生产成本。研究人员拟从土壤样品中分离该类酵母，并进行大量培养。下图所示为操作流程，请回答下列问题：
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(1)配制培养基时，按照培养基配方准确称量各组分，将其溶解、定容后，调节培养基的__pH__，及时对培养基进行分装，并进行__高压蒸汽(湿热)__灭菌。
(2)取步骤②中不同梯度的稀释液加入标记好的无菌培养皿中，在步骤③中将温度约__50 ℃__(在25 ℃、50 ℃或80 ℃ 中选择)的培养基倒入培养皿混匀，冷凝后倒置培养。
(3)挑取分离平板中长出的单菌落，按步骤④所示进行划线。下列叙述合理的有__a、b、d____。
a．为保证无菌操作，接种针、接种环使用前都必须灭菌
b．划线时应避免划破培养基表面，以免不能形成正常菌落
c．挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测定酵母细胞中甲醇的含量
d．可以通过逐步提高培养基中甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株
(4)步骤⑤中，为使酵母数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和__氧气__供应。为监测酵母的活细胞密度，将发酵液稀释1 000倍后，经等体积台盼蓝染液染色，用25×16型血细胞计数板计数5个中格中的细胞数，理论上__无__色细胞的个数应不少于__30__，才能达到每毫升3×109个活细胞的预期密度。
[解析] (1)配制培养基时，进行计算、称量、溶化后，需先调pH再分装到锥形瓶中进行高压蒸汽灭菌。
(2)倒平板时的培养基温度约为50 ℃，冷凝后倒置培养。
(3)平板划线时，接种针、接种环使用前和每次划线后都需要进行灼烧灭菌，以免造成杂菌污染，a正确；划线时不能划破培养基表面，否则不能形成正常菌落，b正确；挑取菌落时，应挑取多个不同的菌落，分别测定酵母细胞中蛋白质含量，c错误；逐步提高培养基中甲醇的浓度，能筛选出其中的耐受菌，获得耐受高甲醇的菌株，d正确。
(4)酵母是兼性厌氧型真菌，在有氧条件下可大量繁殖。酵母扩大培养时，需保证充足的营养和氧气等条件。由题中信息“经等体积台盼蓝染液染色”可知，计数室中培养液容积实际只有0.1÷2＝0.05 mm3。设5个中方格中无色(活细胞不能被台盼蓝染色)的细胞数目为x个，则3×109＝x/5×25×1 000×1 000÷0.05，解得x＝30(个)。
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