课题一 DNA的粗提取与鉴定
专题五 DNA和蛋白质技术
1.血细胞在蒸馏水中会渗透吸水过度而导致细胞膜和细
胞核膜的破裂。利用此特性可得到含有DNA的溶液。
2.DNA在氯化钠溶液中的溶解度，是随着氯化钠的浓度
的变化而改变的。DNA在物质的量浓度为0.14 mol／L
的氯化钠溶液中的溶解度最低，利用这一原理，可以使
溶解在氯化钠溶液中的DNA析出。
3.DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些物质则可以
溶于酒精。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质
较少的DNA。
4.DNA遇二苯胺（沸水浴）会变成蓝色，因此，二苯
胺可以作为鉴定DNA的试剂。
1.制鸡血细胞液
（活鸡鲜血经分离或沉淀获得）
0.1g/mL柠檬酸钠100mL
活鸡鲜血180mL
500mL烧杯中，玻棒搅拌，
离心、分离或静置沉淀。
2.提取DNA
①取血细胞5-10mL＋20mL蒸馏水，用玻棒沿一个方向
快速搅拌。
②纱布过滤：滤液中含DNA和其他核物质，如蛋白质。
③原理：血细胞的细胞膜、核摸吸水胀破，玻璃棒快速
搅拌，机械加速血细胞破裂。
（1）提取血细胞核物质：
（2）溶解核内的DNA：
滤液＋2mol/L的NaCl溶液40mL，玻棒沿一个方向轻缓
搅拌。
（3）析出含DNA的粘稠物：
（4）滤取含DNA的粘稠物：
在上述溶液中缓缓加入蒸馏水，并沿一个方向轻轻搅
拌，出现丝状物；当丝状物不在增加时，停止加水
（此时NaCl溶液的浓度相当于0.14mol/L）。
用多层纱布过滤，含DNA的粘稠物留在纱布上。
（5）DNA粘稠物的再溶解：
20mL2mol/L的NaCl溶液
步骤⑷含DNA的粘稠物
在20mL烧杯中轻缓搅拌
3min，使尽可能多的
DNA溶解在NaCl溶液
（6）过滤含有DNA的NaCl溶液：
用放有两层纱布的漏斗过滤步骤（5）所得的溶液，
滤液中含有DNA。
（7）提取含有杂质较少的DNA：
步骤（6）所得的滤液＋体积分数为95%的冷却酒精
50mL，用玻棒沿一个方向轻缓搅拌，溶液中（析出）
出现乳白色丝状物，用玻棒将丝状物卷起，并用滤纸
吸取上面的水分。
3.DNA的鉴定：
加入二苯胺试剂4mL，用玻棒搅拌使DNA溶解，沸水
浴5min，观察溶液是否出现浅蓝色。
1.共有“三次过滤，两次析出，七次搅拌”
2.加入“两次蒸馏水，三次NaCl溶液，一次酒精”
1.DNA的释放
DNA主要在鸡血细胞的细胞核内，正常情况下不会释
放出来，蒸馏水对于鸡血细胞是一种低渗液，水分可
以大量进入血细胞，使之胀破，同时加上玻璃棒快速
搅拌的机械作用，加速血细胞的细胞膜和核膜的破裂。
但释放出来的大量DNA与RNA、蛋白质结合在一起，
即释放的不是纯净的DNA，常称为DNA核蛋白。
2.DNA与蛋白质分离
在高浓度（2mol/L）的氯化钠溶液中，核蛋白易溶解，
析出DNA并溶解在高浓度的氯化钠溶液中。
3.DNA的析出与获取
因为DNA在低浓度（ 0.14mol/L ）的氯化钠溶液中溶
解度小，而蛋白质的在其中的溶解度大。所以在向含
DNA的高浓度的氯化钠溶液中加入大量蒸馏水稀释
氯化钠溶液，从而使DNA溶解度下降，蛋白质溶解
度增高。
4.DNA的沉淀和浓缩
对于除去了蛋白质的DNA的氯化钠溶液，必须再进一
步沉淀和浓缩，常用酒精沉淀法。即往含有Na＋的
DNA溶液，加入体积分数为95%的冷却酒精，混匀后
可以使DNA沉淀、浓缩，形成含杂质较少的DNA丝状
物，悬浮于溶液中。若丝状物较少，可将混合液再放
入冰箱中冷却几分钟即可。浓缩后的DNA丝状物可以
用玻棒（玻棒有吸附DNA的作用）缓缓旋转的方法卷
起。
5.DNA的再溶解
用高浓度（2mol/L）的氯化钠溶液再溶解DNA粘稠物。
6.DNA的鉴定
100℃
DNA＋二苯胺 蓝色物
鉴定时蓝色的深浅与溶液中DNA的含量多少有关。
方法步骤 加入物质 目的
1. 制备鸡血细胞液 柠檬酸钠溶液 ①
2. 提取鸡血细胞细胞核物质 20 m1蒸馏水 ②
3. 溶解细胞核内的DNA 2 m1／L的 NaCI溶液40mL ③
4. 析出含DNA 的黏稠物 蒸馏水 ④
5. 滤取含DNA的黏稠物 ⑤
6. 将 DNA的黏稠物再溶解 2 mol／L的 NaCl溶液20 mL ⑥
7. 过滤含DNA的 NaCl 溶液 ⑦
8. 提取含有杂质较少的DNA 冷却的95％的酒精50 mL ⑧
A: (1) 向试管中加入0. 015 mol／L的 NaCl溶液5mL
(2) 加入DNA
(3)4 mL 二苯胺试剂 9. DNA 的鉴定
B: (1) 向试管中加入0. 015mol／L 的 NaCl溶液5mL
(2)4 m L二苯胺试剂
⑨
①加入柠檬酸钠溶液的目的是防止血凝固
②加速血细胞破裂
③溶解DNA
④使2mol/L的NaCl溶液稀释至0.14mol/L使得DNA最
大限度地释出
⑤使含DNA的黏稠物被留在纱布上
⑥使含DNA的黏稠物尽可能多的溶解于溶液中
⑦除去含DNA的滤液中的杂质
⑧提取DNA
⑨ A出现蓝色 B无变化
1.在DNA的粗提取实验过程中，两次向烧杯中加入蒸
馏水的作用是( )
A.稀释血液、冲洗样品
B.使血细胞破裂、降低NaCl浓度使DNA析出
C.使血细胞破裂、增大DNA溶解量
D.使血细胞破裂、提取含杂质较少的DNA
B
2.实验中NaCl的物质的量浓度为2 mol／L
和0.14 mol／L对DNA有何影响?
答：前者是溶解DNA，后者是使DNA析出
3.DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成( )
A.砖红色 B.橘黄色
C.紫色 D.蓝色
D
4.提取鸡血中的DNA时，为什么要除去血液
中的上清液?
答：DNA的提取，关键是对杂质的去除，由于上清液
是血液中的血浆部分，不含DNA，所以要除去上清液
(含有蛋白质)。
20
5.下列图示中能反映DNA溶解度与NaCl溶液浓度
(mol/L)之间的关系的是（ ）C
0.14
DNA溶
解
度
0.14
0.14 0.14
DNA溶
解
度
DNA溶
解
度
DNA溶
解
度
A B
C D NaCl浓度
NaCl浓度
NaCl浓度
NaCl浓度
21
6.在DNA的粗提取实验过程中，两次向烧杯中加入蒸
馏水的作用是( )
A.稀释血液、冲洗样品
B.使血细胞破裂、降低NaCl浓度使DNA析出
C.使血细胞破裂、增大DNA溶解量
D.使血细胞破裂、提取含杂质较少的DNA
B
7.DNA在 NaCl溶液中的溶解度有两重性，随着 NaCl
溶液浓度的变化而变化。
(1)请在下列浓度的 NaCl溶液中，选出能使DNA析出最
彻底的一种和溶解度最高的一种__________。
A．0.14 mol/L B．2 mol/L
C．0.15 mol/L D．0.3 mol/L
(2) DNA不溶于酒精，但细胞中的某些物质却可以溶于
酒精溶液，利用这一原理可以__________，可以推测溶
于酒精中的可能有_______________ 。
22
A、B
去除杂质
某些盐类、蛋白质、糖类
或其他大分子物质
专题五 DNA和蛋白质技术
课题二 多聚酶链式反应扩增
DNA片段
【课题背景】
在刑事侦破案件中常需要对样品DNA进行分析，
PCR技术能快速扩增DNA片段，在几个小时内复制
出上百万份的DNA拷贝，有效地解决了因为样品中
DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。
现在PCR技术已广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破
案、古生物学、基因克隆和基因测序。
1.理解PCR的原理和反应过程
2.尝试PCR技术的基本操作
3.讨论PCR技术的应用
PCR仪
以“DNA复制”为背景材料，设计问题，导入新课，首先
回顾DNA的结构和复制的有关知识，然后了解PCR技术的
原理和应用，接着讲解PCR技术的反应过程及具体实验操
作步骤，后以视频观看来再次学习实验的知识点。最后通
过课堂检测完善所学内容。
通过对PCR反应过程的教学，应以读图识图为主。教材中
反应过程图解详细的描绘了参与PCR的各种组成成分；每
一轮反应的三个基本步骤—变性、复性、延伸；每一步骤
的作用。在教学中分析图形的同时，结合教科书中的文字
说明来加深理解。
【设计思路】
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
1.胞内DNA复制的基本体系
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成子链的原料
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3’
端开始连接脱氧核苷酸
（一）PCR原理
2.DNA双链方向与复制关系
DNA合成总是从子链
的5 ´端向3 ´端伸
3 ´端
5 ´端
（2）DNA聚合酶只能从3 ´端延伸DNA链，故DNA
复制需要引物。
（1）DNA的羟基“－OH”末端称为3’端，而磷酸基
团的末端称为5’端。
3.PCR原理
（1）DNA的热变性原理
通过控制温度来控制双链的解聚与结合
①变性：80－100°C的温度范围内， DNA双螺旋结构
解体，双链分开
加热变性
②复性：温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链重新
结合成双链
缓慢冷却复性
（2）耐高温的Taq DNA聚合酶
（3）缓冲液为PCR反应提供的物质
DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四
种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温
度使DNA复制在体外反复进行
【方法点拨】细胞内复制和PCR不同点
① PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的
DNA单链，其长度通常为20－30个脱氧核苷酸
② PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对
反应温度的控制来实现的
（二）PCR的反应过程
PCR一般要经历三十多次循环，每次循环分为变性、
复性和延伸三步。
(1)变性
温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解旋为单链。
(2)复性
温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与
两条单链DNA结合。
温度上升到72 ℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、
T、C、G)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对
原则合成新的DNA链。
(3)延伸
【方法点拨】
(1)72 ℃左右时，TaqDNA聚合酶有最大活性，可使
DNA新链由5′端向3′端延伸。
(2)DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间
的DNA序列，使该段固定长度的序列呈“指数式”
扩增。
1.PCR仪
（一）设备及用具
一台能够自动调控温度的仪器
2.微量离心管
一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml
3.微量移液器
用于定量转移PCR配方中的液体
，其上的一次性吸液枪头用一次
更换一次
1.准备
2.移液
（二）实验操作步骤
按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实
验桌上。
用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里
面加入各种试剂。
3.混合
①过程：
盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。
②注意:
A.离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液
体外溢。
B.手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应
液混合均匀。
4.离心
①过程：
将微量离心管放在离心机上,离心约10s。
②目的：
使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。
循环数 变性 复性 延伸
第一次 94°C，
10min
－ －
30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min
最后一次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min
5.反应
将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。
【注意事项】
避免外源DNA等因素的污染
①隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及
蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；
②分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头。
（一）理论上DNA扩增数目的计算
1.一条DNA，复制n次， DNA为2n
2.a条DNA，复制n次， DNA为a ×2n
（二）实验中DNA含量的测定
1.原理
可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在
260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小
与DNA的含量有关。
2.过程
①稀释
2uLPCR反应液，加入98uL蒸馏水，即将样品进
行50倍稀释
②对照调零
以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分
光光度计的读数调节至零
③计算
取DNA稀释液100uL至比色杯中，测定260nm处的光
吸收值
④计算
DNA含量（g）＝50 x(260nm的读数）x 稀释倍数
50：1 g /mL的DNA在厚度为1cm比色杯中的吸光值
为0.02
紫外分光度计 比色杯
PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技
术。 它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重
复性好、易自动化等突出特点
例如：PCR产物每轮循环增加一倍，30轮循环扩
增量达230个拷贝（109拷贝）
【课堂小结】
一、PCR原理
1.变性：温度上升到90 ℃(90～96 ℃)以上时，双链
DNA解旋为单链
2.复性：温度下降到50 ℃(40～60 ℃)左右时，两种引
物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
3.延伸：溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在
Taq DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配
对原则合成新的DNA链
二、PCR操作
1.准备 2.移液 3.混合 4.离心 5.反应
1.标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大
步，这三大步需要的温度依次是( )
A．92 ℃、50 ℃、72 ℃
B．72 ℃、50 ℃、92 ℃
C．50 ℃、92 ℃、72 ℃
D．80 ℃、50 ℃、72 ℃
栏
目
链
接
A
栏
目
链
接
【方法点拨】
1.变性：
温度上升到90 ℃(90～96 ℃)以上时，双链DNA解旋
为单链
2.复性：
温度下降到50 ℃(40～60 ℃)左右时，两种引物通过
碱基互补配对与两条单链DNA结合
3.延伸：
溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在Taq DNA
聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的
DNA链
2.PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点
不同，它们是（ ）
①PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA
②PCR过程不需要DNA聚合酶
③PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对
反应温度的控制来实现的
④PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为
模板进行复制
A．③④ B．①② C．①③ D．②④
C
【方法点拨】
1.PCR过程需要耐高温的DNA聚合酶
2.PCR过程中，DNA不依靠解旋酶解旋，而是利
用高温解旋，然后以单链DNA为模板进行复制
3.在PCR实验操作中，下列说法不正确的是( )
A．在微量离心管中添加各种试剂时，只需一个枪头
B．离心管的盖子一定要盖严，防止液体外溢
C．用手轻弹离心管壁的目的是使反应液充分混合
D．离心的目的是使反应液集中在离心管部，提高反
应效果
A
3.离心10s的目的是使反应液集中在离心管部，提
高反应效果。
【方法点拨】
1.在微量离心管中添加各种试剂时，每吸取一种
试剂后，移液器上的枪头必须更换，以确保实验
的准确性；
2.离心管的盖子一定要盖严，防止实验中脱落或
液体外溢；
课题三 血红蛋白的提取和分离
专题五 DNA和蛋白质技术
主要概念：①凝胶色谱法 ②电泳法 ③缓冲溶液
主要原理：①凝胶色谱法分离蛋白质的原理
②电泳法分离样品的原理
③缓冲溶液的组成和作用机理
课题重点：凝胶色谱法的原理和方法
课题难点： ①样品的处理
②色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。
体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，
并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。
课题背景
蛋白质是生命活动不可缺少的物质。随着人类基因组计
划的进展以及多种生物基因组测序工作的相继完成，人
类跨入了后基因组和蛋白质组时代
对蛋白质的研究与应用，首先需要获得纯度较高的蛋白
质。因此从复杂的细胞混合物中提取、分离高纯度的蛋
白质是生物科学研究中经常要做的工作
血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，
负责血液中O2和CO2的运输。在本课题中，我们将以血
红蛋白为实验材料，学习蛋白质提取和分离的一些基本
技术。
血红蛋白
Ø含量
Ø组成元素
Ø分子质量
Ø基本单位
Ø氨基酸连接方式
细胞中含量最多的有机物
C、H、O、N等
高分子化合物，分子量很大
R
H
C COOH
NH2
氨基酸
结构通式：
种类：20种
脱水缩合
一个氨基酸的氨基（—NH2）和另一个氨基酸的羧基
（—COOH）相结合，同时脱去一分子H2O
CO NH
氨基酸 肽链 蛋白质
脱水缩合 盘曲折叠
（一条或者多条）
Ø钛键
Ø分子结构
NH CO
Ø蛋白质结构的多样性
①氨基酸的种类不同；②数目成百上千；
③排列顺序变化多端；④多肽链的空间结构千差万别
Ø蛋白质功能的多样性
运输、调节、免疫、催化等，生命活动的承担着
Ø基本思路
选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化
学性质的生物大分子。
Ø基本原理
根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、
所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他
分子的亲和力等，可以用来分离不同种类的蛋白质。
凝胶实际上是一些微小的多孔球体。如：浮石、琼脂、
琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等。
Ø凝胶色谱法
l 概念：
凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的
大小分离蛋白质的方法之一，又称分子筛层析。
l 凝胶：
—血红蛋白的分离方法
当不同的蛋白质通过凝胶时
相对分子质量较小 相对分子质量较大
凝胶内部的通道
容易进入 无法进入凝胶内
部的通道
只能在凝胶外部移动
路程较长
移动速度较慢
路程较短
移动速度较快
相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离
l 原理：
l 凝胶色谱分离蛋白质的具体过程
带电粒子在电场作用下发生迁移的过程
—血红蛋白的分离（鉴定）方法Ø电泳
l 概念：
l原理：
许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解
离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负
电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带
电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种
分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不
同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品
中各种分子的分离。
依据：电泳支持介质是聚丙烯酰胺和琼脂糖。
琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳
l类型：
琼脂糖有一个相对较大的孔径，用来分离大分子
例如核酸、大蛋白和蛋白复合物等，聚丙烯酰胺
形成孔径较小的胶，适合于分离大多数蛋白和小
片段核酸。
聚丙烯酰胺
丙烯酰胺和交联
剂N,N’-亚甲基双
丙烯酰胺在引发
剂和催化剂的作
用下发生交联共
聚反应形成
Ø蛋白质在琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电
泳中的迁移率取决于它所带净电荷的
多少以及分子的大小等因素。
ØSDS（十二烷基硫酸钠）能与各种蛋白质形成蛋白质
-SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质
分子原有电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷
差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（—分子量测定）
ØSDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的
蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因
此测定的结果只是单条肽链的分子量
讨论：如何测定蛋白质的分子量？
使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，
可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据
已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率
和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分
子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标
准蛋白试剂出售。
Ø缓冲溶液
在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加
稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，
具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。
l作用：
能够抵制外界的酸或碱对溶液的PH值的影响，维持
PH基本不变。
l配制：
通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓
冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的
缓冲液。
l常用：
NaH2PO4 / Na2HPO4
H2CO3/NaHCO3
你认为在血红蛋白整个实验中用的缓冲液是什么？它
的目的是什么？
磷酸缓冲液；目的：是利用缓冲液模拟细胞内的PH环
境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)
和科学研究(活性)。
思考：
生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH
下进行的，为了能够在实验室条件下准确模拟生物
体内的过程就必须保持体外的pH与体内的基本一致。
因此，缓冲溶液的正确配制和pH的准确测定，在生
物化学的研究工作中有着极其重要的意义。
在生物化学的研究工作，为什么要配制缓冲溶液和准
确测定缓冲溶液的pH？
蛋白质的提取和分离一般分为四步：
Ø样品处理
Ø粗分离
Ø纯化
Ø纯度鉴定（电泳）
红细胞的洗涤
血红蛋白的释放
分离血红蛋白溶液
透析—去除样品中分子量较小的杂质
用凝胶色谱法除去相对分子质量较大的杂质
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
样品采集
Ø样品处理
1. 用鸡的红细胞提取DNA，用哺乳动物的红细胞提取
血红蛋白的原因是什么？
鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的
提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含
量丰富，便于提取血红蛋白。
血
液
血浆 水 分
其他物质：血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡
萄糖等
血细胞
白细胞
血小板
红细胞
（最多）
血红蛋白
（90％）
两个α－肽链
两个β一肽链
四个亚铁红素基团
2. 血液有哪些成分？
血红蛋白
两个α－肽链
两个β一肽链
四个亚铁红素基团
每个肽链环绕一个亚铁血
红素基团，此基团可携带
一分子氧或一分子二
氧化碳，血红蛋白因含有
血红素而呈红色。
血红蛋白的特点：
l采集血液样品
注意：加入抗凝血剂柠檬酸钠
l红细胞的洗涤
•洗涤目的
去除杂蛋白（血浆蛋白）利于后续步骤的分离纯化
•洗涤方法
采用低速短时间离心，如500r／min,离心2min然后用
胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的
红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水(质
量分数为0.9％的NaCl溶液)，缓慢搅拌10min，低速短
时间离心，如此重复洗涤三次直至上清液中没有黄色，
表明红细胞已洗涤干净。
为什么要采用低速短时间离心？
初次离心后的结果 3次洗涤后的结果
能否用蒸馏水代替生理盐水？
不能；生理盐水能保持红细胞的渗透压而不至于破
裂，若红细胞提前破裂，使血红蛋白与杂质血浆蛋
白混在一起加大分离难度。
l血红蛋白的释放
将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏水到原血液
的体积，再加40％体积的甲苯，置于磁力搅拌器上
充分搅拌10min。在蒸馏水和甲苯的作用下，红细
胞破裂释放出血红蛋白。
思考：蒸馏水和甲苯有什么作用？
蒸馏水的作用：使红细胞大量吸水胀裂
甲苯的作用：溶解红细胞的细胞膜
磁力搅拌器 搅拌器转子
搅拌器正在工作
l分离血红蛋白的溶液
将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2000 r／min的
速度离心10min后，可以明显看到试管中的溶液分为4
层：
第1层（最上层）：甲苯
层（无色透明）
第2层（中上层）：脂溶
性物质沉淀层（白色薄层
固体）
第3层（中下层）：血红蛋白
的水溶液层（红色透明液体）
第4层（最下层）：杂质
沉淀层（暗红色）
用滤纸过滤除去
脂溶性沉淀层，
于分液漏斗中静
置片刻后，分出
下层的红色透明
液体。
Ø粗分离 --透析（去除分子量较小的杂质）
取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛
有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中
（pH为7.0）透析12h
1、透析袋的本质是什么？
2、透析的原理？
半透膜：玻璃纸、肠衣、膀胱膜。
透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。
---凝胶色谱（去除相对分子量较大的杂质蛋白）
Ø纯化
l凝胶色谱柱的制作
①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂
纸磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液
管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到
玻璃管的一端。
注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡
皮塞的凹穴底面否则难以铺实尼龙网还会导致液体
残留，蛋白质分离不彻底。
③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。
④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。
⑤安装其他附属结构。
凝胶色谱柱的制作
①凝胶的选择：
A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）
②凝胶的前处理：
配置凝胶悬浮液：
计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充
分溶胀后，配成凝胶悬浮液。
l凝胶色谱柱的装填
③凝胶色谱柱的装填方法：
A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。
B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱 内，
装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。
C、洗涤：用300ml缓冲液充分洗涤12h
注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之
间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在。因为
空隙或气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低
分离效果。
装配好的凝胶柱
①加样前
打开下端出口，使柱内凝
胶面上的缓冲液缓慢下降
到与凝胶面平齐，关闭出
口。
l样品的加入与洗脱
注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面
2、贴壁加样 3、使吸管管口沿管壁环绕移动
②加透析样品
③ 样品渗入凝胶床
加样后，打开下端出口，
使样品渗入凝胶床内。
等样品完全进入凝胶层
后，关闭下端出口。
④ 洗脱和收集
小心加入物质的量浓度为
20mmol／L的磷酸缓冲液(pH
为7.0)到适当高度，连接缓
冲液洗脱瓶，打开下端出口
进行洗脱。
待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流
出液，每5ml一试管，连续收集。（在分离过程中，
如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成
功）。
血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样
品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红
细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白
溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的
杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对
分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经
聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。
你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？
操作提示
Ø红细胞的洗涤
Ø色谱柱填料的处理
Ø凝胶色谱柱的装填
Ø蛋白质的分离
观察你处理的血液样品离心后是否分层，如果分层不
明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。
此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴
细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血
红蛋白的提取纯度。
1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后
的样品发生了哪些变化吗？
2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱
柱装填得成功吗？你是如何判断的？
由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁
放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得
均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝
色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。
如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能
良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体
以消除气泡，消除不了时要重新装柱。
如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，
能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，
随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变
宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有
关。
3、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动吗？
请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？
1.以下关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确的是( )
A．洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂
B．猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂
蛋白较少
C．血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测
D．在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小
的杂蛋白移动慢
【解析】 洗涤红细胞时，洗涤的目的是去除杂蛋
白以利于后续步骤的分离纯化，加入的是生理盐水，
可防止红细胞破裂，A正确；哺乳动物成熟的红细胞
没有细胞核与众多的细胞器，提纯时杂蛋白较少，B
正确；血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离
时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱
液，C正确；在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白的
分子量比杂蛋白大，质量越大的，通过凝胶色谱柱
的速度越快，D错误。
【答案】 D
2.将处理破裂后的红细胞混合液以2000 r/min的速
度离心10 min后，离心管中的溶液分为四层，从上
到下的顺序依次是( )
A．血红蛋白、甲苯层、脂质物质层、细胞破碎物
沉淀层
B．甲苯层、细胞破碎物沉淀层、血红蛋白、脂质
物质层
C．脂质物质层、血红蛋白、甲苯层、细胞破碎物
沉淀层
D．甲苯层、脂质物质层、血红蛋白、细胞破碎物
沉淀层
【解析】 将处理破裂后的红细胞混合液以
2000 r/min的速度离心10 min后，离心管中的
溶液分为四层，从上到下的顺序依次甲苯层、
脂质物质层、血红蛋白、细胞破碎物沉淀层，
D正确。
【答案】 D
3.在血红蛋白分离过程中如果红色带区歪曲、散
乱、变宽，与其有关的是 ( )
A．凝胶色谱柱的制作
B．色谱柱的装填
C．洗脱过程
D．样品的处理
【解析】 色谱柱装填时不能有气泡的存在，气
泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，若色谱柱
装填得很成功、分离操作也正确，则能清楚的看
到红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓缓
流出，如果出现红色带区域歪曲、散乱、变宽的
现象，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的
装填有关，B项正确，A、C、D三项均错误。
【答案】 B
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